教材研究：必修3教材中出现胚胎干细胞可以用于基因敲除，获得基因敲除动物，如用基因敲除手段可以获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。如理解此应用，需要了解基因敲除技术

一、基因敲除的研究史

基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。

基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。

80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。

1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。

到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。

二、基因敲除的步骤

第一步：基因载体的构建

把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV-TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因失活（灭活）。

第二步：ES 细胞的获得

现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。

将打靶载体通过显微注射技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。

机理：使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。

[转载]对基因敲除的了解

第三步：用选择培养基筛选靶ES细胞

由于基因转移的同源重组自然发生率极低，需要筛选。用含新霉素的培养基筛选所有能表达neo基因的细胞，用含GCV的培养基淘汰所有能表达HSV-TK基因的细胞（含HSV-TK基因的细胞能将无毒的GCV转化成有毒的药物）。

第四步：表型研究

是将筛选出来的靶ES细胞导入小鼠的囊胚中，再将此囊胚植入代孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，筛选获得基因敲除小鼠。

通过观察嵌合体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。

第五步：得到纯合体

由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。

通过观察小鼠基因敲除前后的生物学性状的变化，可以达到研究目的基因（敲除基因）的功能的目的；通过敲除抗原决定基因，还可获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除免疫排斥反应。